Neuzvraćena ljubav je tema koja se ponavlja u predstavi, jer je nekoliko likova zaljubljeno u nekoga tko im ne uzvraća ljubav. Na primjer, Viola je zaljubljena u vojvodu Orsina, koji je zaljubljen u Oliviju. Olivia je pak zaljubljena u Cesarija (koji je zapravo prerušena Viola). Ovo stvara složenu mrežu neuzvraćene ljubavi koja pokreće veći dio akcije i humora u predstavi.
Pogrešni identitet također je ključno obilježje predstave. Viola se prerušava u čovjeka po imenu Cesario kako bi ušla u Orsinovu službu. Ovo prerušavanje dovodi do brojnih nesporazuma i komplikacija, budući da drugi likovi pogrešno zamijene Violu za muškarca i zaljube se u nju. Pogrešni identitet također stvara prilike za Violu da promatra i komentira druge likove, što doprinosi humoru predstave.
Sve u svemu, neuzvraćena ljubav i pogrešan identitet dvije su ključne značajke koje doprinose humoru i složenosti Dvanaeste noći.