Florey je rođen u Adelaideu, Južna Australija, kao sin ravnatelja škole. Pohađao je St Peter's College u Adelaideu i Sveučilište u Adelaideu, gdje je diplomirao s diplomom diplomiranog znanosti 1921. i doktora medicine 1924. godine.
Nakon što je završio medicinu, Florey je radio na Institutu za medicinska istraživanja Walter i Eliza Hall u Melbourneu, gdje je upoznao Ernsta Chaina. Godine 1928. preselili su se na Sir William Dunn School of Pathology na Sveučilištu u Oxfordu, gdje su počeli raditi na razvoju penicilina.
Penicilin je 1928. godine otkrio Alexander Fleming, ali se nije razvio u upotrebljiv lijek. Florey i Chain uspjeli su izolirati aktivni sastojak penicilina i pročistiti ga kako bi se mogao ubrizgavati pacijentima. Također su razvili metode za masovnu proizvodnju penicilina, što je omogućilo njegovu široku upotrebu tijekom Drugog svjetskog rata.
Rad Floreya i Chaina na penicilinu spasio je nebrojene živote tijekom Drugog svjetskog rata i napravio revoluciju u liječenju zaraznih bolesti. Florey je 1945. godine dobio Nobelovu nagradu za fiziologiju ili medicinu, a 1944. godine proglašen je vitezom.
Florey je također bio istaknuti administrator i pedagog. Bio je prorektor Sveučilišta u Oxfordu od 1959. do 1962., a bio je i predsjednik Londonskog kraljevskog društva od 1960. do 1965. Također je bio član Australske akademije znanosti, Američke akademije znanosti i umjetnosti. , i Nacionalna akademija znanosti.
Florey je umro od moždanog udara u Oxfordu 1968. Smatra se jednim od najvažnijih australskih znanstvenika 20. stoljeća, a njegov rad na penicilinu spasio je milijune života.